制药行业应用 ׀ 清洁验证样品的总有机碳（TOC）分析

在清洁验证程序开发过程中，关键目标是工艺验证：通过分析数据证明该过程的每一步都能将产品和清洁剂残留去除到预定的可接受水平。美国食品药品监督管理局（FDA）1993 年的指南要求任何验收标准都必须 “具有科学依据” 。这些标准会因所采用的清洁程序类型（例如在线清洁（CIP）或离线清洁（COP）），以及清洁程序是在同一产品的不同批次之间进行还是在更换产品类型时进行而有所不同。了解用户所测试的分析物和清洁剂残留的类型（例如蛋白质发酵液样品和阳离子表面活性剂）也很重要。这些参数决定了验证程序的检测方法。

TOC 分析正迅速成为清洁验证的优选分析方法，原因如下：许多制药公司都在采用基于全产品方法开发清洁验证方法，即确定是否存在任何残留，而不考虑其来源（包括产品、清洁剂、化学品、溶剂、副产品、降解物和微生物污染物等）。这种方法与 TOC 分析配合良好，因为 TOC 分析能够检测分子结构中含碳的任何 API 或清洁剂残留。詹金斯（Jenkins）等人发现 TOC 分析在清洁验证中的应用得到了有力支持：“TOC 检测限低、分析时间短、与其他方法相比成本较低，并且能够检测所有含碳残留物” 。通过对比 TOC 分析、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法、分光光度法（UV）、酶联免疫吸附测定法、电泳法、pH 值检测、电导率检测和目视分析法，他们发现 TOC 分析的性能与 HPLC 和分光光度法相当，甚至更优。

越来越依赖 TOC 分析的其他原因还包括：

• 初始资金投入、运行和维护成本相对较低

• 操作简便

• 灵敏度高

• 难降解分析物的回收率高

• 干扰小

在开发阶段，使用一种或多种能够代表实际清洁验证过程中遇到的活性剂类型的模型化合物对分析技术进行测试，以此展示该技术的稳健性、准确性和精密度。

牛血清白蛋白（BSA）是一种可以很好地模拟其他蛋白质类、难氧化 API 的化合物。血清白蛋白是所有哺乳动物血浆中常见的一种蛋白质，也是最为人熟知且经过深入研究的蛋白质之一。通过核磁共振（HNMR）和 X 射线晶体学分析，BSA 大致呈心形，含有 607 个氨基酸残基，分子量约为 66317.25 原子质量单位（amu） 。BSA 本身作为活性剂在制药行业中应用广泛，同时也是开发稳健的清洁验证分析方法的理想模型化合物。蛋白质很难被氧化，当使用蛋白质化合物作为测试剂开发 TOC 检测方法时，对于与其他活性剂和抗氧化性较弱的分析物相关的分析结果，人们可以给予高度信任。

实验目的是使用 BSA 作为模型化合物，确定 TOC 分析仪的线性响应范围，以便开发清洁验证方法，应用赛莱默旗下品牌 OI Analytical Aurora 1030W TOC 分析仪和 1088 自动进样器（图 1）。

实验使用的校准曲线（图 2）展示了 Aurora 1030W TOC 分析仪在较宽的碳浓度范围内进行高精度校准的能力。该仪器使用 KHP 进行校准，KHP 是一种广泛使用且易于氧化的标准物质。图 2 中的校准曲线由 PC 软件生成，该软件与 Aurora 1030W 配备的触摸屏软件相同。响应因子表示仪器以每 1000 个面积计数中 μg C 为单位的响应值。

图 2：Aurora 1030W TOC分析仪的KHP校准曲线

以确定 1030W TOC 分析仪对 BSA 的线性响应范围为目标。这一概念与仪器校准类似，能够揭示仪器对 BSA 浓度呈线性响应的工作范围。测试结果在图 3 中以每个样品的 BSA 浓度与 TOC 分析仪的面积计数响应值的关系图呈现。数据显示，Aurora 1030W 能够分析浓度约为 0.5 - 20ppm 的 BSA。

图3：BSA 浓度与 TOC 面积计数关系图

作为一种难氧化的蛋白质，BSA 在其他研究中显示出回收率低和仪器响应不佳的问题。但这些数据表明，加热过硫酸盐氧化技术能够在较宽的工作范围内彻底消解 BSA 样品中的碳，并实现完全回收。如果绘制的图采用二阶最佳拟合曲线，则表明仪器对 BSA 的回收不完全。在这些情况下，数据通常代表分析仪消解 BSA 的稳健性上限；随着样品浓度的增加，仪器响应相对保持不变。

下表进一步展示了 Aurora 1030W 在分析 BSA 等蛋白质样品时可达到的精密度和准确度。在分析时，制备了已知浓度的 BSA 样品。由此可以计算出理论碳浓度，并与测量得到的碳浓度进行比较。根据 BSA 的分子量 66317.25amu 和碳的质量百分比 53.065%，可以通过以下公式将碳浓度与 BSA 浓度关联起来：

数据显示，加热过硫酸盐技术能够以高精度（平均相对标准偏差为 2.5%）和高准确度（平均回收率为 87%）分析 BSA 样品。

在清洁验证中，确定碳的适当回收率至关重要。为了准确评估系统回收率，必须确定理论浓度与实际浓度的斜率。在图 4 中，绘制了表 2 中测定的 BSA 回收率，并得出了斜率。

图4：BSA碳回收

由于 BSA 中理论碳含量预期为 53.065%，我们可以根据以下公式计算实际碳含量：
理论浓度/直线斜率=实际浓度
对于 BSA，53.065/1.1317=46.8896%碳。

通过了解分析仪的回收率，就可以为未来测定未知样品中 BSA 含量的实验确定合适的范围。